關(guān)鍵詞：細(xì)菌；耐藥機理；控制措施

自從青霉素問世以來，抗菌藥物在臨床上的應(yīng)用取得了令人矚目的效果。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性也隨之。近年，由抗菌藥的使用不當(dāng)而引發(fā)的耐藥細(xì)菌也越來越多，耐藥范圍越來越廣，程度越來越高，多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并且耐藥性可通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人群，從而極大地危害人類自身的安全。本文將對細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機理以及耐藥性的控制措施進行如下闡述。

1　細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的分子生物學(xué)機理

1.1　細(xì)菌產(chǎn)生破壞藥物結(jié)構(gòu)的滅活酶

這一類的耐藥細(xì)菌常常可以產(chǎn)生一種或多種滅活酶或鈍化酶來水解或修飾進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物，使之失去生物活性，這是引起細(xì)菌耐藥性的最重要的機制。該酶主要有β­內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、紅霉素類鈍化酶等。

1.1.1　β­內(nèi)酰胺酶(β­lactamase)　這是細(xì)菌對β­內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。該類酶可以是染色體介導(dǎo)，也可為質(zhì)粒介導(dǎo)。前者通過改變β­內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位即青霉素結(jié)合蛋白(PBP)；后者通過水解和非水解方式，使β­內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵斷裂而使抗生素失去抗菌活性。Bush等將β­內(nèi)酰胺酶分為4型，Ⅰ型是不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶(AmpC酶)，Ⅱ型是能被抑制劑所抑制的β­內(nèi)酰胺酶，Ⅲ型是不被抑制劑(乙二胺四乙酸和對甲酸除外)所抑制的金屬β­內(nèi)酰胺酶，Ⅳ型是不被克拉維酸抑制的青霉素酶。以第Ⅰ、Ⅱ型尤為重要，Ⅰ型酶為染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的AmpCβ­內(nèi)酰胺酶，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，其AmpC沒有調(diào)控基因，呈持續(xù)高表達，按染色體起源分為5個家族：①枸櫞酸桿菌起源的LAT族；②未知起源的FOX族；③陰溝腸桿菌起源的Entb族；④摩氏摩根菌起源的Morg族；⑤蜂房哈夫尼菌起源的Haf族。染色體介導(dǎo)的AmpC酶分為4種：①Ia誘導(dǎo)型，見于陰溝腸桿菌；②Ib持續(xù)型，見于大腸埃希菌；③Ic誘導(dǎo)型，見于普通變形桿菌；④Id誘導(dǎo)型，見于銅綠假單胞菌。Ⅱ型酶是由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生的超廣譜β­內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β­lactamases，ESBLs)， 至2007年11月20日全國已發(fā)現(xiàn)ESBLs有500余種[1]，根據(jù)編碼基因同源性的不同分為TEM、SHV、CTX­M、OXA和其他5類。

1.1.2　氨基糖苷類鈍化酶　細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥性的最重要的原因就是產(chǎn)生了對這一類藥物的共價修飾酶。該酶分為3類，即乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC) 、磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)和腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(AAD)。它們能將氨基糖苷類抗生素的游離氨基乙�；�、游離羥基磷酸化或核苷化，使藥物不易進入細(xì)菌體內(nèi)，也不易與細(xì)菌內(nèi)靶位(核糖體30 S亞基)結(jié)合，從而失去抑制蛋白質(zhì)合成的能力。已發(fā)現(xiàn)的基因型已超過30種，其中G－桿菌以aac(3)­Ⅰ、aac(3)­Ⅱ、aac(6′)­Ⅰ、aac(6″)­Ⅱ、ant(3″)­Ⅰ、ant(2″)­Ⅰ基因為常見；G＋球菌以aac(6′)/aph(2″)、aph(3″)­Ⅲ、ant(6)­Ⅰ基因為常見。Robiscek A等[2]證實了質(zhì)粒介導(dǎo)的氨基糖苷類抗生素乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(6′)­Ib­Cr對喹喏酮類藥物有活性，首次發(fā)現(xiàn)了由一種基因編碼的酶對兩類結(jié)構(gòu)不同的抗生素底物同時有活性的現(xiàn)象。

1.1.3　氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶　此酶為一種胞內(nèi)酶，由cat基因家族編碼，其表達產(chǎn)物修飾氯霉素使之失活。

1.1.4　紅霉素類鈍化酶　此酶是一種體質(zhì)酶，由質(zhì)粒介導(dǎo)。包括：①紅霉素酯酶：腸桿菌可攜帶ereA基因和ereB基因表達紅霉素酯酶使紅霉素酯解失活；②紅霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶：由mphA，mphB和mphC基因編碼，其表達產(chǎn)物可使紅霉素脫氧二甲胺己糖C­2′位置發(fā)生磷酸化或糖基化而失活[3]；③維吉尼亞霉素酰基轉(zhuǎn)移酶：此酶在葡萄球菌中由vatA、vatB、vatC編碼，在腸球菌中有vatD、vatE編碼。其表達產(chǎn)物對維吉尼亞霉素活性有修飾作用。

1.2　靶位的改變

藥物作用靶位改變后會使其失去作用位點，從而使藥物失去作用。研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌可通過erm基因編碼核糖體甲基化酶，使位于核糖體50 S亞單位的23 S rRNA的腺嘌呤甲基化，導(dǎo)致抗菌藥物不能與其結(jié)合部位結(jié)合[4]。至今為止，已檢出erm基因20余種，常見的有ermA、ermC、ermAM[5]；細(xì)菌的16 S rRNA基因發(fā)生突變時，氨基糖苷類藥物將對其失去作用；喹諾酮類藥物主要作用于細(xì)菌的DNA回旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ而起抗菌作用，當(dāng)編碼DNA回旋酶的gyrA(突變部位集中在Ser83附近)、gyrB基因，編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC、parE基因突變時，通過其表達產(chǎn)物的構(gòu)象改變而導(dǎo)致耐藥，由此研究者提出了突變抑制濃度(mutants prevention concentration，MPC)的概念[6­7]。肺炎鏈球菌可通過其青霉素結(jié)合蛋白基因(pbp1A、pbp2B)突變，對青霉素類藥物產(chǎn)生耐藥[8]。

1.3　細(xì)菌生物被膜的形成

細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BBF)是指細(xì)菌黏附于固體或有機腔道表面，形成微菌落，并分泌細(xì)胞外多糖蛋白復(fù)合物將自身包裹其中而形成的膜狀物。細(xì)菌形成生物被膜后，往往對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，其主要原因有：①細(xì)菌生物被膜中的胞外多糖起屏障作用，可減少抗菌藥物滲透；②吸附抗菌藥物鈍化酶，促進抗菌藥物水解；③細(xì)菌在生物被膜下代謝低下，對抗菌藥物敏感性降低；④生物被膜的存在阻止了機體對細(xì)菌的免疫力，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象，減弱機體免疫力與抗菌藥物的協(xié)同殺菌作用[9]；⑤生物被膜的形成有利于抗生素外排泵的合成[10]。能形成細(xì)菌生物被膜的臨床常見致病菌有銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌等。

1.4　阻礙抗菌藥向細(xì)菌內(nèi)的滲透

細(xì)菌細(xì)胞壁的障礙或細(xì)胞膜通透性的改變，使抗菌藥無法進入細(xì)胞內(nèi)達到作用靶位而發(fā)揮抗菌效能，這是細(xì)菌自身的一種防衛(wèi)機制。該類細(xì)菌主要見于革蘭氏陰性菌，與其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有關(guān)。細(xì)菌發(fā)生突變失去某種特異孔蛋白后即可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，如大腸埃希菌由于外膜蛋白F(OmpF)的缺失，OmpC的增多(有時下降)致使某些藥物失去抗菌作用[11]，引起OmpF缺失的機制主要是由于細(xì)菌染色體的mar區(qū)基因突變所致。大腸埃希菌mar基因位于細(xì)菌染色體34分位處，mar位點以maro為中心，包含2個操縱子，其中maro是mar的調(diào)控區(qū)，它包含有轉(zhuǎn)錄啟動子和MarA、MarR蛋白結(jié)合位點。

1.5　主動外排系統(tǒng)(外排泵)

細(xì)菌細(xì)胞膜上存在一類蛋白，在能量支持下，將藥物選擇性或非選擇性地排出細(xì)菌細(xì)胞外，此過程稱為主動外排系統(tǒng)亢進，從而使達到作用靶位的藥物濃度明顯降低而導(dǎo)致耐藥[12]。

與細(xì)菌多重抗菌藥耐藥性有關(guān)的主動外排泵系統(tǒng)主要歸于以下5個家族/類[13]：①ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體類[ATP­binding cassemembrane affinity filtration(ABC)transporters，ABC類]；②主要易化超家族(major facilitator superfamily，MFS類)；③藥物與代謝物轉(zhuǎn)運體家族[drug/metabolite transporter (DMT)superfamily] ，此類外排轉(zhuǎn)運體中與細(xì)菌耐藥性相關(guān)的是一類“小多重耐藥性(small multi­drug resistance，SMR類)”外排泵；④多重藥物與毒物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion，MATE)；⑤耐受­生節(jié)­分裂家族(resistance­nodu1ation­division[RND]family，RND類)。以上各類轉(zhuǎn)運體中除ABC類以ATP水解能量驅(qū)動外排泵外，其余各類均以質(zhì)子驅(qū)動力為能量，并形成質(zhì)子與藥物的反轉(zhuǎn)運體。

近年已研究了多種細(xì)菌的主動外排系統(tǒng)，如大腸埃希菌RND多重藥物主動外排泵系統(tǒng)AcrA­AcrB­TolC[14]，并且在對多重耐藥大腸埃希菌的研究中發(fā)現(xiàn)其存在四環(huán)素和水楊酸鈉的主動外排系統(tǒng)[15]，銅綠假單胞菌主動外排系統(tǒng)MexAB­OprM、MexCD­OprJ 、MexEF­OprN[16]，枯草桿菌細(xì)胞膜上Bmr等主動外排系統(tǒng)[17]。藥物的主動外排系統(tǒng)已被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。此外，整合子屬可移動基因元件，能攜帶重組的基因盒插入到轉(zhuǎn)座子或接合性質(zhì)粒中，在不同的細(xì)菌間運動而傳播耐藥性，同時一個整合子可以捕獲多個基因盒， 使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥[18]。

2　控制細(xì)菌耐藥性的主要措施

2.1　一般性措施

2.1.1　對疫病做出準(zhǔn)確診斷，合理使用抗菌藥。這就要求基層獸醫(yī)人員提高診斷技能和加強相關(guān)醫(yī)療知識，對癥下藥。掌握用藥常識，先窄譜后廣譜，先一線后二線的給藥順序及聯(lián)合用藥，應(yīng)嚴(yán)格控制抗菌藥物的濫用，對非細(xì)菌感染性疾病不要盲目的使用抗菌藥。在使用抗菌藥治療疾病前，有條件的應(yīng)作藥物敏感性試驗，科學(xué)的選擇高敏、低毒的藥物。

2.1.2　在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，盡量做到不用抗菌藥物來預(yù)防疾病，應(yīng)提高動物機體免疫力，通過其自身來抵御疫病的感染。

2.1.3　加強獸藥管理，嚴(yán)厲打擊假藥和劣質(zhì)產(chǎn)品。獸藥生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行GMP標(biāo)準(zhǔn)，獸藥經(jīng)營企業(yè)應(yīng)取得GSP認(rèn)證。

2.1.4　嚴(yán)密監(jiān)測抗菌藥的耐藥性，提供耐藥性流行資料。一經(jīng)發(fā)現(xiàn)耐藥性，應(yīng)減少該類藥物的使用，甚至停止使用。

2.2　藥物本身的改進

2.2.1　采用中藥手段消除R質(zhì)粒，控制細(xì)菌耐藥性　中藥具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的特點，從中藥中選擇用于體內(nèi)的R質(zhì)粒消除劑，對于控制細(xì)菌耐藥性的傳播與中藥的開發(fā)利用都具有十分重要的意義。中藥體外作用表現(xiàn)為單一耐藥性的丟失，體內(nèi)作用卻表現(xiàn)為多重耐藥性的丟失[19]。單味中藥的質(zhì)粒消除率要低于復(fù)方，可能是使用性能功效相似的同類藥物組成復(fù)方起到協(xié)同作用，增強藥物的療效[20]。羅音久[21]對大腸埃希菌環(huán)丙沙星耐藥性的消除進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花地丁提取物對大腸埃希菌環(huán)丙沙星耐藥性有消除作用。

2.2.2　尋找不使用抗生素來治療細(xì)菌感染的新策略　①破壞耐藥基因，使耐藥菌恢復(fù)對抗生素的敏感性；②開發(fā)抗菌肽，因其獨特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊作用機理，已引起人們極大的研究興趣；③研發(fā)更多特異性強的細(xì)菌疫苗。

2.2.3　研制和開發(fā)新的抗菌藥物　根據(jù)細(xì)菌耐藥性的發(fā)生機制及其與抗菌藥物結(jié)構(gòu)的關(guān)系，尋找和研制具有抗菌活性，尤其對耐藥菌有活性的新抗菌藥。如采用納米技術(shù)等新技術(shù)，提高藥物的靶向作用及緩釋性等特性，以加強新型抗生素及其復(fù)合制劑的研究。

2.2.4　開發(fā)利用噬菌體制劑　不同種類的噬菌體溶菌機制存在著差異，具有大基因組的噬菌體依靠hollin蛋白­內(nèi)溶素系統(tǒng)[22]，而小基因組的噬菌體僅編碼一種溶解蛋白，可起到類似于青霉素樣的作用，通過阻礙細(xì)胞壁的合成而殺菌。

2.2.5　研制細(xì)菌的頡頏劑�、贉缁蠲敢种苿�。已有3種β­內(nèi)酰胺酶抑制劑，包括克拉維酸、舒巴坦和三唑巴坦，它們都具有β­內(nèi)酰胺環(huán)，可以與β­內(nèi)酰胺酶競爭性結(jié)合，保護青霉素和頭孢菌素類藥物不被滅活，但其本身抗菌活性卻極小，常與其他抗菌藥物合用；②膜通透劑。一些抗生素如多黏菌素、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，增加膜的通透性而達到抗菌作用；③外排泵抑制劑。Marquez B等[23]從麻瘋樹屬植物的根莖中提取得到化合物，屬于吡啶二羧酸酯類，對金黃色葡萄球菌中的NorA泵有較好的抑制作用， Maria R F等[24]從25種巴西傳統(tǒng)植物中提取得到的9個化合物，對耐藥的金黃色葡萄球菌有較高活性；喹諾酮類藥物外排泵抑制劑MC­207110，能明顯抑制銅綠假單胞桿菌的Mex外排泵系統(tǒng)和大腸埃希菌的AcrAB外排泵系統(tǒng)；13­CPTC是四環(huán)素(TC)的衍生物，能競爭性地與細(xì)菌B型四環(huán)素外排泵[Tet(B)protein]結(jié)合，阻斷Tet(B)與TC結(jié)合，從而避免細(xì)菌將TC排出胞外；④細(xì)菌生物被膜抑制劑。司帕沙星對生物被膜具有較好的通透性，且其殺菌作用不依賴細(xì)菌的生長率，故對生物被膜內(nèi)細(xì)菌具有良好的清除作用，是治療細(xì)菌生物被膜感染的良好選擇�？死�霉素可抑制銅綠假單胞菌BF的形成，并可增強環(huán)丙沙星對有BF的銅綠假單胞菌的殺菌作用。